تئوری فلورسانس و فسفرسانس مولكولی

طیف سنجی نشر فلورسانس

فلورسانس و فسفرسانس جزء فرآیندهایی هستند که شامل جذب انرژی تابشی نور مادون قرمز، مرئی یا فرابنفش می‌شوند، که به دنبال آن مقداري انرژی آزاد می‌شود که متعاقباً شناسایی و اندازه‌گیری می‌شود. در مجموع، فلورسانس، فسفرسانس، و نورتابی شیمیایی به عنوان لومینسانس مولکولی شناخته می شوند. در نورتابی شیمیایی، یک گونه برانگیخته از طریق یک واکنش شیمیایی تشکیل می شود که منجر به آزاد شدن انرژی می شود. انواع مختلفی از لومینسانس از جمله رادیولومینسانس، الکترولومینسانس و بیولومینسانس وجود دارد. مهتابی، انتشار تشعشع از یک سیستم گرم به دلیل شرایط دمای بالا است. از طرف دیگر لومینسانس شامل همه انواع دیگر انتشار نور می شود. بیشتر مولکول‌های آلی و ترکیبات معدنی وقتی به حالت‌های الکترونیکی بالاتر برانگیخته می‌شوند، درخشنده شده یا فوتون ساطع می‌کنند. در پروتئین ها، اسیدهای آمینه آروماتيك تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین فلورسانس می کنند. نوکلئوتیدهای سیتوزین، تیمین، گوانین، اوراسیل و آدنین در DNA و RNA فلورسانس می کنند. ترکیبات آروماتيك بزرگترین گروه از ترکیبات لومینسانس را تشکیل می دهند. فلورسانس و فسفرسانس فرآیندهای نورتابی هستند که در آن انرژی فرودی است که گونه ها را تحریک می کند و منجر به گسیل فوتون می شود. فلورسانس در مقایسه با فسفرسانس، که در آن آزاد شدن انرژی تقریباً آنی است، فرآیند سریع‌تری است. فسفرسانس گسیلی است که با تغییر در اسپین الکترون همراه است که منجر به تابش تا چند ثانیه می شود.

تئوری فلورسانس و فسفرسانس

جذب انرژی تابشی

انرژی تابشی توسط اتم ها یا مولکول ها در واحدهای معینی جذب می شود که به آنها کوانتوم می گویند. یک کوانتوم انرژی (E) با فرکانس نوسانات آن نسبت مستقیم دارد:

v = فرکانس (s^-1)

λ = طول موج (نانومتر یا سانتی متر)

h = ثابت پلانک (6.626 × 10^-34 Js)

c = سرعت نور (3.0 × 10⁸ m/s)

در فیزیک، مقدار انرژی با کار با استفاده از واحدهای ژول، J، مرتبط می‌شود. اغلب در طیف‌سنجی واحدی که برای نمایش انرژی استفاده می‌شود، سانتی‌متر معکوس (cm^-1) است که در آن hc ~ 2 × 10^-23 است. کمیتی که در محاسبات بازده کوانتومی استفاده می‌شود، انیشتین است بر اساس تعداد مولکول‌ها برحسب مولکول گرم به صورت N کوانتومی، که در آن N = 6.023 × 10²³  است. به این ترتیب، جذب یک انیشتین انرژی مورد نیاز برای واکنش یک انیشتین است. مول گرم گونه های برانگیخته با جذب تابش فرودی (نور)، که انرژی را به مولکول ها می دهد، تشکیل می شوند. سپس مولکول های برانگیخته مقداری از این انرژی را به صورت گسیل نور آزاد می کنند. بازدهی که در آن نور جذب می شود و سپس آزاد می شود راندمان کوانتومی (ΦE) نامیده می شود و به صورت زير توصیف می شود:

توجه داشته باشید جایی که کوانتوم گسیل شده برابر با کوانتوم جذب شده است، بازده کوانتومی واحد یا برابر با 1 خواهد بود. بنابراین، از آنجایی که کوانتوم گسیل شده هرگز نمی تواند بیشتر از کوانتوم جذب شده باشد، بازده کوانتومی همیشه کمتر یا مساوی 1 خواهد بود (ΦE ≤ 1).

نمودار جابلونسکی

نمودارهای جابلونسکی جذب و نشر نور را توصیف می کنند و فرآیندهای مولکولی مختلفي را نشان می دهند که در حالت های برانگیخته در طول فلورسانس اتفاق می افتد. شکل 2-1 شماتیکی از نمودار جابلونسکی است. در نمودار جابلونسکی، S₀ حالت پایه منفرد را نشان می دهد و S₁ و S₂ به ترتیب حالت های برانگیخته اول و دوم منفرد را نشان می دهند. T₁ به معنای اولین حالت سه گانه است. هنگامی که یک فلوروفور نور را جذب می کند، از حالت پایه منفرد به حالت های برانگیخته اول یا دوم برانگیخته می شود. تبدیل دروني معمولاً زمانی اتفاق می افتد که مولکول های فلوروفور برانگیخته از حالت برانگیخته دوم به حالت برانگیخته اول آسايش پيدا مي كنند. این فرآیند معمولاً قبل از شروع نشر اتفاق می‌افتد، بنابراین به طور کلی می‌بینیم که طیف جذب و انتشار تصاویر آینه‌ای یکدیگر هستند، زیرا الکترون‌های برانگیخته شده هندسه هسته را تغییر نمی‌دهند. عبور بین سیستمی زمانی اتفاق می افتد که الکترون ها در اولین حالت برانگیخته S₁ به حالت سه گانه T₁ منتقل می شوند. این فرآیند منجر به فسفرسانس مي شود که در مقایسه با فلورسانس انرژی کمتری دارد.

حالت های برانگيخته و اسپین الکترون

برانگیختگی گونه‌های اتمی و مولکولی می‌تواند به اشکال مختلفی رخ دهد. برای مثال، پرتوهای گاما واکنش‌های تحریک هسته‌ای ایجاد می‌کنند، پرتوهای ایکس انتقال الکترون‌های اتمی درونی، نورهای فرابنفش و مرئی انتقال الکترون‌های اتمی بیرونی، فروسرخ ارتعاشات مولکولی، و فروسرخ دور چرخش‌های مولکولی ایجاد می‌کنند. همه اینها نمونه هایی از برانگیختگی هستند که از جذب انرژی فرودی ایجاد می شود. در فلورسانس و فسفرسانس، فرآیندها شامل الکترون های اتمی بیرونی می شوند. به عنوان مثال جذب انرژی کلسیم اتمی گازی در 7/422 نانومتر را در نظر بگیرید که یک الکترون لایه ظرفیتی را از سطح 4s به سطح 3d تحریک می کند. پس از چند ثانیه، اتم انرژی را در طول موج 7/422 نانومتر در تمام جهات آزاد می کند و به حالت پایه باز می گردد. برای اتم ها، طول موج گسیل شده اغلب با طول موج جذب شده یکسان است، زیرا اتم ها سطوح انرژی ارتعاشی مشابه با مولکول ها ندارند. اين نوع فلورسانس با آزاد شدن انرژی بدون تغییر فرکانس به عنوان فلورسانس رزونانسي شناخته می شود و در اتم های برانگیخته رایج است. بیشتر مولکول‌های آلی به دلیل تغییری که به عنوان تغییر استوکس شناخته می‌شود، انرژی را در طول موج طولانی‌تر از طول موج تحریک آزاد می‌کنند.

فسفرسانس

فسفرسانس با فلورسانس متفاوت است. در فسفرسانس تغییر اسپین الکترون وجود دارد که منجر به افزايش طول عمر حالت برانگیخته از ثانیه تا دقیقه می شود. در مقایسه، فرآیند فلورسانس (عمدتاً حالت منفرد) شامل تغییر اسپین الکترون (حالت سه‌گانه) نمی‌شود که منجر به طول عمر حالت برانگیختگی بسیار کوتاه‌تر در مرتبه کمتر از ^5-10 ثانیه می‌شود. اگرچه نظریه کوانتومی وجود یک حالت برانگیخته سه گانه را پیش بینی می کند، انتقال مستقیم از حالت منفرد پایه به حالت سه گانه برانگیخته ممنوع است. فرآیندی که حالت سه‌گانه را ایجاد می‌کند، عموماً از یک حالت منفرد برانگیخته ناشی می‌شود که دارای پایین‌ترین سطح ارتعاشی است که همان انرژی سطح ارتعاشی بالایی حالت سه‌گانه را دارد. تبدیل از حالت منفرد برانگیخته به حالت سه گانه برانگیخته به عنوان عبور بین سیستمی شناخته می شود و در شکل 2-1 نشان داده شده است. انتشار نور با فسفرسانس در مقایسه با فلورسانس با تأخیر است. در فلورسانس، انتقال از حالت منفرد برانگیخته به حالت پایه با گسیل نور با سرعت از ^6-10 تا ^9-10 ثانیه صورت می گیرد. در فسفرسانس، انتقال از حالت سه گانه برانگیخته به حالت پایه بسیار کندتر و با مرتبه ^4-10 تا ^2-10 دقیقه است. پس از عبور بین سیستمی، حالت سه گانه برانگیخته انرژی کمتری نسبت به حالت منفرد برانگیخته مرتبط دارد. بنابراین، مشاهده می‌کنیم که نشر در فسفرسانس در طول موج‌های بالاتر نسبت به فلورسانس انجام می‌شود.

طیف برانگيختگي و نشر

همانطور که در نمودار جابلونسکی دیدیم، هنگامی که یک سیستم انرژی تابشی فرودی را جذب می کند و یک الکترون را به حالت برانگیخته می رساند، حالت فلورسنت همراه با آزاد کردن انرژی است. شکل 2-2الف یک طیف از طول موج 200 تا 700 نانومتر برای جذب و نشر را نشان می دهد. در طول موج کمتر، چهار باند جذبي در 240، 290، 340 و 410 نانومتر وجود دارد. باندهای نشان دهنده نشر انرژی در طول موج های طولانی تر 500، 580، 625 و 680 نانومتر هستند. باندهای نشر یا فلورسانس در فرکانس پایین تر (طول موج بلندتر) برای اکثر ترکیبات آلی مشاهده مي شوند. این پديده به نام تغییر استوکس شناخته می شود. در ساده ترین حالت، تغییر تقریباً 10 نانومتر خواهد بود. با این حال، این اغلب همانطور که در شکل شکل 2-2الف مشاهده می شود، صادق نیست. معمولاً وقتی یک مولکول انرژی را جذب می کند و الکترون به حالت انرژی بالاتر ارتقا می یابد، فرآیندهای آسايش اتفاق می افتد که مقدار کمی از انرژی جذب شده اولیه را آزاد می کند. اغلب فرآیند آسايش به صورت آسايش ارتعاشی و تبدیل درونی است. به دنبال این، این ترکیب انرژی را به صورت فلورسانس نشر می کند، اما در سطح انرژی پایین تر، که ما آن را به عنوان تغییر استوکس می بینیم (که به آن تغییر قرمز نیز می گویند). شکل 2-2ب پوششی از خطوط جذب و نشر را نشان می دهد که در نمودار جابلونسکی شکل 2-1 نشان داده شده است. این به ما ایده بهتری از طیف جذب و نشر و نحوه ارتباط آنها با فرآیندهای انرژی که در نمودار جابلونسکی نشان داده شده است، می دهد.

ثابت هاي سرعت بازده کوانتومی

معادله كلي برای بازده کوانتومی فلورسانس و فسفرسانس به صورت بیان شده است:

k_fluor (فلورسانس): آزاد شدن انرژی بورت نشر تابشي بدون تغییر اسپین مانند S به S_.

k_intcon (تبدیل دروني): انتقال به حالت پایین تر زمانی که سطوح انرژی ارتعاشی بدون انتشار تابشي با هم همپوشاني دارند.

k_extcon (تبدیل بيروني): انتقال به حالت پایین تر با غیرفعال سازي برخوردي بدون نشر تابشي.

k_ICS (عبور بین سیستمی): انتقال با تغییر اسپین الكترون مانند S به T.

k_predis (پیش تجزيه): آسايش به حالت پایه با انرژی کافی براي شكستن پيوندها مولكولي.

k_dis (تجزیه): برانگیختگی به حالت ارتعاشی با انرژی کافی برای شکستن پیوندها و ایجاد گسستگی.

عوامل مؤثر بر فلورسانس

فلورسانس و فسفرسانس مشابه آنالیز UV-Vis در غلظت‌های پایین هستند که در هر دو رابطه مستقیمی بین غلظت و شدت نشر وجود دارد. ما می‌توانیم طیف‌های استاندارد را در طیف‌سنجی UV-Vis جمع‌آوری کنیم که در اکثر موارد از ابزاری به ابزار دیگر و آزمایشگاهی به آزمایشگاه دیگر قابل تکرار هستند. طیف استاندارد تحت شرایط استاندارد طول موج‌ها، طول مسير عبور باريكه داخل نمونه و غلظت‌های خاص جمع‌آوری می‌شوند که اغلب به عنوان ضرایب جذب مولی گزارش می‌شوند. شيمي تجزيه دان می تواند طیف های جمع آوری شده در یک کتابخانه را با طیف های جمع آوری شده در آزمایشگاه خود مقایسه کند و غلظت ها را در شرایط استاندارد با استفاده از ضرایب جذب مولي محاسبه کند. در مورد فلورسانس و فسفرسانس، این مورد عملي نیست. عواملی وجود دارند که طیف‌ها را منحرف می‌کنند و بر آن‌ها تأثیر می‌گذارند که برای به دست آوردن طیف‌های واقعی (مستقل از ابزار) نیاز به اصلاح دارند. تأثیرات تحریف کننده هم مبتنی بر ابزار و هم مبتنی بر نمونه است.